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正文摘录:

·2·Journalo，Cliniod删ExperimentalMedicinebz.6.№.8.,tug.2007组，第l组不予任何治疗，第2组予三联疗法治疗，并将10只正常SPI；’级BALB／c小鼠设为第3组。第l组(治疗组)：10只小鼠。造模后8周的第1～7天，每天先禁食12h，予泮立苏溶液0.25Inl及氨苄青霉素0.25IIll加克拉霉素0.1ml灌胃，灌完胃后再禁食3～4h，每天1次，连用7d。于最后一次灌胃后2周全部处死小鼠。第2组(模型组)：10只小鼠。造模后不予任何处理。与第1组小鼠同时处死。第3组(正常组)：lO只小鼠。不造模，亦不予任何处理，与第1组小鼠同时处死。小鼠处死后立即解剖，取完整的胃组织(包括十二指肠、胃窦、胃体等)，部分胃黏膜组织用10％的甲醛溶液固定送病理科行Giemsa染色，部分组织行快速尿素酶试验(观察时间5min)、涂片及细菌培养。用快速尿素酶试验、Giemsa染色和微需氧细菌培养检测Hp定植，以验证Hp是否成功感染，剩余组织用于分子生物学检测。1.2.3判断标准Hp的三种检测方法：快速尿素酶试验、Giem—sa染色和Hp的细菌培养中两项阳性诊断为Hp感染。胃黏膜慢性炎症的评分标准参照文献”J。1.2.41]LR4和IL—lp在核酸水平表达的检测提取胃黏膜组织RNA后用两步法逆转录PCR(RT—PCR)检测’rLR4和IL一1B的表达，95~C3min，95~C4JDs；53％，50s(B—actin、IL—18)，58℃，508(11LR4)；。72~C，50s共30循环；72℃，10min，4~C保存备用。行聚丙烯酰胺凝胶电泳，紫外灯下观察结果。采用凝胶图像分析系统，Gel—Aanlyzer4.O软件(美国MediaCybernetic公司)，根据电泳条带的面积和亮度计算出每个条带的积分光密度。以待测细胞因子的光密度对同一标本B—actin(内参照)光密度的比值表示该细胞因子mRNA的表达水平。Tl脚}和IL一1B、B—actin的引物见表1。表l本试验中各种细胞因子的引物1.2.5蛋白质印记法(Westernblotting)测定唧4、儿一1B的表达提取胃黏膜蛋白后上样，86V跑胶80rain，100～120v转膜O.75—1h，将膜上转有Marker的一部分剪下作考马斯亮蓝染色，剩余的膜放于封闭液中封闭。在室温封闭lh后，移至4℃，100：RPM。加一抗：1山‘rLR4、IL一1B一抗稀释于3ml封闭液中(1：3000)，混匀，转人杂交袋中，将膜转入杂交袋中，赶走所有气泡，用封口机封好杂交袋，转轱上，室温，100RPM，1h。洗一抗：0.1％’triton—PBS·40ml漂洗一次。0.1％‘l~iton—PBS80IIll×15min×3次，100RPM，室温；O.1％。triton一封闭液80mlx15min×1次，100RPM，室温。加二抗：O.5m二抗稀释于5111l0.1％’triton封闭液中(1：10000)，混匀，转入杂交袋中，赶走所有气泡，用封口机封好杂交袋，转轱上，室温，100RPM，lh。洗二抗：O.1％‘Triton—PBS40IIIl漂洗一次；0.1％Tnton—PBS60ml×15min×3次，150RPM。ECI。液显色4min后显影1min，定影5ann，洗片晾干。采用凝胶图像分析系统，Gel—Aanlyzer·4.0软件，根据电泳条带的面积和亮度计算出每个条带的积分光密度。1.2.6统计方法运用SPSS13.O统计软件进行数据处理，计量数据以均数±标准差(i±s)表示，计量资料采用LSD法处理，以P＜O.05为差异有统计学意义。计量资料之间的相关分析用Pearson分析。2结果2.1各种细胞因子在核酸水平的表达2.1.1各组样本中11LR4的表达第2组小鼠胃黏膜内|rJ.R4的表达较第1组明显降低(P＜0.05)。RT—PCR凝胶电泳检测结果见图l，半定量图比较图见图2。2.1.2各组样本中IL—lp的表达第2组小鼠胃黏膜内IL一1p的表达较第1组明显降低(JP＜O.05)。RT—PCR凝胶电泳检测结果见图1，半定量图比较见图2。l23Ml23M图1各组小鼠胃黏膜组织中TLR4、IIJ—IB的表达图A：为各组小鼠胃黏膜组织中TLR4的表达；各组小鼠胃黏膜组织中IL一1B的表达。‘Ⅱ矗IL-l匝匦亚巫叵固图2~'g1'bm.WWf膜组织中TLR4、II.一lB表达的半定量比较(；±s.n=10)2.1.3TLR4与IL一1p表达的相关性r11.R4与IL—lB呈正相关(r=O.392，P＜0.05)。2.2各种细胞因子在蛋白水平的表达2.2.1各组样本中11.R4的表达第2组小鼠胃黏膜内Ⅱ.R4的表达较第l组明显降低(P＜0.05)。Westernblotting凝胶电泳检测结果见图3，半定量图比较图见图4。2.2.2各组样本中IL—lB的表达第2组小鼠胃黏膜内IL一1B的表达较第1组明显降低(P＜0.05)。Westernblotting凝胶电泳检测结果见图3，半定量图比较图见图4。