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正文摘录:

中国医药工业杂志Chinese.10remlof.Phar’maceuticals2005，36(9)先加核酸沉淀剂后加酶液(其余试剂和测定步骤同样品管)的试管作为空白对照。酶活力定义为：在所述测定条件下，1min催化生成的核苷酸使260nm处的吸收度A差值为1.0时的酶量为一个单位。1米氏常数‰的测定：用双倒数法Ⅲ测定以酵母RNA为底物时1的‰值。·537·2实验结果2.1酶的分离纯化发酵液离心后得粗酶液330ml，分别测定各步处理后的酶蛋白含量和活力，计算比活及纯化倍数，结果见表1。表1各分离步骤的纯化结果由表1可见，超滤后酶比活略有下降；当加入硫酸铵至饱和度70％时，上清液残留酶活仅为14％，且酶蛋白沉淀的酶比活较高，纯化倍数为1.52；透析后的酶比活提高至5911u／mg；获得的酶蛋白样品经DE一52型树脂分离的结果见图1。酶活力测定结果表明，第29管开始有酶活性，至第3l管达到最大值，酶比活及纯化倍数均最高。11019283。7465564试管号图1柱层色谱分离结果柱色谱分离曲线基本呈现单一蛋白质洗脱峰，说明经硫酸铵沉淀和DE一52型树脂分离后基本可除去杂蛋白和色素。进一步以SDS—PAGE电泳检测上述第31管内样品的纯度，结果见图2。由图2可见，l的电泳图谱为分子量约36k的单一条带，和文献㈨基本一致，证明柱色谱分离后1酶液纯度较高。2.2‰的测定绘制相同底物浓度时酶活力.反应时间图，拟合趋势线，求出斜率，以计算某一底物浓度条件下∞m《qw～——94k—nn——67k‘’-————————43k镧黼嘲黼龄蜊目㈣％——30k121—1；2一标准分子量蛋白图2SDS.PAGE电泳图谱的酶促反应速度。再以双倒数法用最小二乘法作图，求得底物为酵母RNA时1的‰为3.36mmolA。。2.31的部分酶学性质研究采用不同pH的醋酸缓冲液配制底物，在25℃分别测定粗酶液和柱色谱分离后所得纯酶液的酶活力，结果见图3。二者的最适反应pH相差不大，分别约为5.2、5.4。二200i150≥100鎏50O4.85，.23.45.6pH—一粗酶液；—·-一纯酶液图3pH对1活力的影响分别取适量粗酶液和纯酶液，在不同pH缓冲液中25℃保温2h，测定残留酶活力，结果见图4。432O0OOO一葛n弋