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正文摘录:

·536·中国医药工业杂志ChineseJoumalofPhaI~aceuticals2005，36(9)·，，，，，，，，，，，，’，，’'，'，，’，，，|.；微生物药物与生物药物≥‘f＜‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘t‘‘‘‘‘‘‘‘一核酸酶P1的分离纯化及部分酶学性质研究廖红东，莫晓燕。，宋威(西安交通大学生命科学与技术学院，陕西西安7119049)摘要：桔青霉发酵液经离心、超滤、硫酸铵盐析、透析和DE一52型树脂柱色谱分离，纯化得到核酸酶P1。比活为28490u，mg，纯化10.5倍，收率为45％。sDs—PAGE电泳显示为单一条带。酶学性质研究结果表明，以酵母RNA为底物时的矗rm为3.36mmol，L，最适作用温度70℃，最适pH5.4。关键词：桔青霉；核酸酶P1；纯化；酶学性质中图分类号：Q93文献标识码：A文章编号：1001.8255(20G15)09—0536—03核酸酶P1(nucleaseP1，EC3.1.30.1，1)为磷酸二酯酶，可将单链RNA或DNA水解为5’一核苷酸或5’.脱氧核苷酸，且无碱基特异性。1广泛用于5’一核苷酸工业，也常用于分子生物学研究_1~引。在现代医学中，1富集，zP后的标记方法已成为分析芳香族和大量非芳香族DNA加合物最灵敏的方法之一。目前高纯度的1基本来自国外，国内仅生产用于制备核苷酸的粗酶液。本研究对桔青霉发酵液中的1进行了分离纯化，并分析了1的部分酶学性质，为生产高纯度1及酶解RNA生产5’.核苷酸的生产工艺参数改进做准备。1材料和方法1.1材料1.1.1仪器J2.Mc型高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；La1DSCaleTFF小型超滤系统(美国Millipore公司)。1.1.2菌株和试剂桔青霉(心，z配illiumcl—trmum)As3.2’788(中国科学院微生物研究所)；酵母RNA(中国医药集团上海化学试剂公司)：DE.52型阴离子交换树脂(上海伯奥生物科技公司)。1.1.3培养基发酵培养基／％：葡萄糖2，麸皮浸出汁2，酵母浸膏O.2，蛋白胨0.2，K2HP040.07，KH2P040.03，CaCl，收稿日期：2004一09.06基金项目：陕西省自然科学基金资助项目(2002C’.20)作者简介：廖红东(1973)，男，硕士研究生，专业方向：基因工程及发酵工程。通讯联系人：莫晓燕(1954)，女，高级工程师，硕士生导师，从事生物制药研究。1色1：029—82668463E—rnail：mO—xy@263.Ⅱet0.09，ZnS040.005，MgS040.01，MnS040.08；pH自然。1.2方法1.2.1发酵方法加适量无菌水至桔青霉斜面中制备孢子悬液∽600≥0.08)，取0.2m1至装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于30℃摇床(180r，min)培养24h，得种子液。再以10％接种量接种至装有30ml新鲜发酵培养基的250Ⅱll三角瓶中，于32℃摇床(180n『min)发酵78h，发酵液去除菌丝体后即得粗酶液。1.2.2分离纯化步骤硫酸铵盐析：收集上述发酵液，经八层纱布滤除大部分菌丝体，滤液于4℃离心(3000r／min)5min去除残留的菌丝体。采用截留分子量为10000的膜超滤2h，去除小分子杂质。滤液加硫酸铵至饱和度70％，4℃静置2h，离心(10000r／min)15min，沉淀用重蒸水溶解，再置4℃生理盐水透析24h。DE.52型树脂柱色谱分离：取透析液离心去除沉淀后，上DE.52型树脂柱(先用pH7.0磷酸盐缓冲液预平衡)，以0～O.5mol／L的NaCl磷酸缓冲液(pH7.0)进行梯度洗脱(洗脱液流速为18m忱，收集管每管体积3m1)，收集具有核酸酶活性的洗脱液。1-3测定方法酶蛋白的测定：以考马斯亮蓝法测定[引。以牛血清白蛋白作标准，对应标准曲线测定酶蛋白含量。SDS—PAGE电泳：采用不连续垂直板状电泳系统r5_进行，分离胶浓度为10％。酶活力的测定：参照文献[s]以Uv法测定。用