0	反刍动物冷冻精液稀释液的应用现状 所投刊社及刊社评论 | 作者个人资料
	投票	0条评论 收藏  推荐本文 博客引用 作者:郭蓉    所属分类: 生物科学

正文 字体大小：大 中 小

反刍动物冷冻精液稀释液的应用现状 摘要：发现和利用于18世纪后期的人工授精技术目前已被广泛应用，是一项成熟的技术，但是目前仍然存在着的一些问题制约了它的发展。人工授精技术涉及许多的环节，每个环节对人工授精效果都会产生不同程度的影响。其中，精液的保存则成为其中的重要一项。精液的保存有鲜精保存和低温保存。本文主要就反刍动物精液冷冻保存中精液稀释液的现状、存在问题等方面作一综述。 关键词：牛，羊，冷冻精液，人工授精，稀释液 Abstract:Artificial insemination has been widely used since later 18 centrury. It is a mature technology. But there still have some problem which inhibit it’s development.Artificial insemination involved several links,each link has different influence on the result of the insemation,among which the semen cryopreservation is the most important aspect. The main idea of this article is focus on the current development and problem of the diluent. Key Word:bull, ram, semen, cryopreservation, diluent, artificial insemination. 前言 1780年，意大利生物学家Spallanzani教授第一次成功利用哺乳动物—狗进行了人工授精试验，到19世纪末和20世纪初，马的人工授精试验成功，然后又用于牛、羊。20世纪40年代开始，人工授精技术的应用蓬勃发展，成为家畜改良的重要手段。随着科学技术的发展和研究手段的完善，关于猪、马、牛、羊和鸡的人工授精的研究进展相当显著。人工授精包含了种公畜的准备、采精、精液的处理、精液的保存、母畜的准备等技术环节，不同的环节有不同的操作程序和注意事项。每一个环节都关系着人工授精的最终效果。 随着人工授精技术的广泛应用，20世纪家畜精液保存技术随之而产生了。精液保存主要是通过降低或是抑制精子的新陈代谢强度从而达到延长精子存活时间的目的。现在的精液保存有三种方法：常温保存（15～25℃）、低温保存（0～5℃）和冷冻保存（-79～-196℃）。由于受时间、地域和年龄等因素的限制，引进活种畜的费用和潜在的一些安全问题，使得优良种公畜不能充分发挥其优势，以提高畜禽品质和扩大优良畜禽数量。因此，冷冻精液技术成为了改变这一状况的重要手段。本文围绕精液冷冻这一主题，简要综述反刍动物在精液冷冻稀释液方面的现状及存在问题，并提出了解决目前冷冻精液存在问题的一些看法。 （一） 精液冷冻保存的概况 1776年，意大利人Spallanzani首先开始精液零度以下保存的研究。他把用于试验的哺乳动物的精子装在小瓶里，并放在雪里，然后放回气温下，观察精子的活动状态。制冷技术出现后，人们便试验在人工低温的条件下保存精液。Mantegazza等试验将人精液降到-17℃。Krzhyshkovskij等（1924年）将蟑螂的精液和哺乳动物的精液放在雪和乙醇混合物中降到-23℃，解冻后观察到一些活动的精子[1]。20世纪初期开始用制冷技术或人工固态气体和液态气体进行精液冷冻。但早期“深冻”精液试验没有成功。但直到20世纪50年代英国的Polge和Smith在牛精液保存液中添加甘油方法冷冻精液获得成功，由此发现了甘油的添加克服了冷冻过程对精子的损害，精液的超长期保存有了重大的突破[4]。甘油低温保存性能的发现，可以说是哺乳动物精液冷冻保存技术发展史上的里程碑，人工授精技术也进入了一个新阶段。 20世纪60年代中期，奶牛业使用了冷冻精液后，逐渐代替了原来的液态保存精液，牛的人工授精头数大大增加。到70年代，牛精液冷冻技术在世界各国迅速发展并应用于生产。据第九届国际繁殖和人工授精会议统计，38个国家牛冷冻精液的普及率达到90%以上的有31个国家。国外用冷冻精液配种母牛数达百万头以上的国家也在不断增多。其中一些国家牛的人工授精已全部使用冷冻精液。以奶牛业为例，美国经过2年的改进，使奶牛产奶量平均每头增加700千克。我国20世纪50年代末开始家畜冷冻精液的研究，至今在牛的精液冷冻保存技术已经形成了一整套规范化的工艺流程，并制定了牛冷冻授精生产使用的国家标准。奶牛冷胚总受胎率达85%～95%，肉牛受胎率达70%～75%。 绵羊冷冻精液保存技术研究主要是在50年代进行的。Emmens等（1950）按Polge和Smith冷冻牛精液的方法，将绵羊精液冷冻到-79℃获得了较高的存活率，1951年输精试验，获得1只流产羔；给679头母羊用冷冻到-79℃的精液输精，产羔率仅5%。Dauzier（1956）用同样的方法，所得受精率仅5%（2/40）。我国绵羊冷冻精液的研究是从1974年开始的。山羊精液冷冻保存技术从1962年起就有许多国家开始试验研究[44]。绵羊冷冻精液的研究和推广取得了较好效果，推动了我国山羊冻精技术的发展，有的地区试验表明，其情期受胎率可达60%。但由于绵羊特殊的生理结构，其冷冻精液的效果仍很低。 在温度变化过程中，精液对精子的保护性能是有限的。为此，进行精液的冷冻保存就要配合使用专用的溶液先将精液进行稀释。对稀释液的基本要求包括pH值、缓冲性、渗透压和低温保护性能。精液在其冷冻前后的质量变化是影响人工授精成功的重要因素。于是，稀释液在精液冷冻保存中突显其重要性。 （二） 精液冷冻保存的稀释液成分 2.1牛冻精的稀释液成分 牛的冷冻精液应用较广的稀释液为：蔗糖-卵黄液，乳糖-卵黄液和葡萄糖-柠檬酸钠液。近年来在稀释液的成分上有了新的突破。 2.1.1糖类 添加到稀释液中的糖类常为葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖等，近来有人发现使用棉子糖的效果更好，但是其价格较高，不易推广。也有人报道，在稀释液中添加海藻糖也可使精子免遭冷冻的伤害。 2.1.2冷冻保护剂 对于冷冻保护剂来说，甘油和二甲基亚砜（DMSO）最为常用，且很多的报道都认为甘油的效果好，因此甘油的应用更为广泛。但甘油本身对精子有一定的毒害，所以人们寻求可以替代它的抗冻物质。1998年，王锋等[14]报道，向稀释液中添加乙二醇或丙二醇，由于二者较甘油和二甲基亚砜更易达非结晶状态，且在该状态下更稳定，同时乙二醇或丙二醇对细胞的毒性小，因此在解冻后虽活力和存活时间未见提高或延长，但精子顶体的完整率显著高于对照组。此外，血清和白蛋白也是较好的保护剂。Moussa 等[56]（2002）报道，以提取的低密度脂蛋白替代卵黄，冷冻保护效果比商业用的稀释液好。Amirat L[48]等比较了在稀释液中添加Biociphos、低密度脂蛋白(LDL)和Trilady1对精液在冷冻前、冷冻过程中及冷冻后对精子的影响。结果发现精子在Biociphos（64%）、LDL（61%）中的运动力比在Trilady1（32%）中增加2倍，且精子细胞在LDL中结构变化不明显。因此，LDL对细胞的有害作用也较弱，向冷冻精液提供了一种较好的保护作用。另外，王锋等[12]用脱脂常乳或初乳部分或全部替代稀释液中的柠檬酸钠，结果说明了使用脱脂常乳或初乳不仅可向精子提供营养物质，还可防休克，减少冷冻-解冻过程中膜蛋白的丢失，延长精子存活时间和提高顶体完整率。李玉凡[13]在其试验中发现，在精液稀释液中添加维生素B12，解冻后的精子在活力和顶体完整率上显著高于对照组，说明维生素B12对牛精子形态结构具保护作用。 2.1.3缓冲物质 在精稀释液中使用三羟甲基氨基甲烷(Tris)等有机物，取得了效果。 2.1.4抗氧化物质 在抗氧化剂方面，由于精子细胞膜的过氧化物反应和脂质过氧化物的产生对精子活动性等产生不利影响。Bilodeau等[53]（2002）报道，在精液稀释液中添加少量的过氧化氢酶和丙酮酸盐不仅可以保持精子的运动，还可增加细胞的ATP水平，二者可以改善常用抗氧化剂的性能。张文举等[10]也报道了谷胱甘肽可以提高母牛的受胎率。 2.1.5抗生素 鉴于精液中如果含菌量过高，则会影响精子的质量，从而会影响受胎率。在稀释液中添加抗生素成为提高精液品质的手段之一。目前，在精液的稀释液中常添加的是青、链霉素。有试验证明，添加了抗生素的精子在受精后的不返情率增高。 2.1.6除精浆 近年来也有报道除精浆提高冻后精子活力的报道，但对其效果，说法不一。马毅等[5]（2001）发现，精浆中许多物质都同精子活力有关，其毒性作用在哺乳动物中普遍存在，除去精浆可提高冻后精子活力。 2.2绵、山羊的精液冷冻保存的稀释液成分 在胡文英等[24]的试验中，将影响多浪羊冷冻精液品质的5个主要因素进行分析后发现，稀释液种类较其它因素在影响冻后精子活率、精子存活时间及精子顶体完整率等方面均为主导因素。由此可见，稀释液在精液冷冻中起着重要的作用。为了提高绵、山羊精液冷冻后能够保持较好品质，研究者们在原来稀释液配方上进一步改善，添加了各种物质，以期得到很好的冻后效果。 2.2.1糖类 大多数研究者发现，提高稀释液的渗透压可以增加冻精的的存活率。例如等渗的柠檬酸盐溶液里添加戊糖可提高冻精存活率，这是由于补偿了由甘油引起的溶液渗透压下降。绵羊精子能忍耐两倍于等渗液的葡萄糖液，这是由于葡萄糖可渗入精细胞中，而使精细胞保持等渗，但双糖没有这种性质。在高宏宝等[23]（2001）报道中，分别使用葡萄糖、蔗糖和乳糖为稀释液组分，冷冻后精子活率以乳糖配制的效果最好（活率为0.57）。在李助南等试验中采用乳糖、葡萄糖和柠檬酸三钠构成的稀释液在冷冻山羊精液上也表现出很好的保护作用，精液解冻后输精受胎率达69.23%。Awad MM等[50]利用两种冷冻剂：甘油和蔗糖，并加于卵黄-Tris组成的稀释液中，进行冷冻效果比较。发现以蔗糖为保护剂，冷冻于牛脂肪上的羊精子在解冻后运动细胞的比例（51%）比用甘油（46%）为保护剂的高。Aisen E等[46]（2005）在公羊稀释液中添加海藻糖，结果发现，精液在解冻后，经海藻糖稀释过的精子中脂质过氧化物的水平比经海藻糖-EDTA（35%）稀释过的解冻精子中的水平要显著低些。说明了当精子保存于海藻糖中时，由冷冻和解冻引起的氧化压力减轻。海藻糖这种抗氧化也许与它在冷冻保存中对膜的保护效力有关。Eiman M等[55]试验以海藻糖替代Tris-柠檬酸混合物，可显著改善山羊精子的冷冻能力，而且作者在试验中也观察到，海藻糖的抗冻作用也许是精子膜流动性增强的原因。 2.2.2冷冻保护剂 高宏宝的试验结果表明，稀释液中甘油的浓度以2%-4%为宜。虽然甘油可作为精液抗冻保护剂，但对精子会产生一定的危害。因此，在金水仙等[36]的波尔山羊冷冻精液试验中，选用乙二醇和丙三醇为稀释保护剂，结果获得了理想的保存效果，乙二醇稀释剂的精子存活率达52.56%，且效果比丙三醇好，细胞渗透压反应也较小。 2.2.3缓冲物质 在稀释液中加入缓冲物质是保证精液适宜的pH值,以利于精子的存活。绵、山羊缓冲物质中均以Tris(简称三基)，效果好，它的高浓度对精子的毒性也较低。也有资料反应乙二氨四乙酸钠（EDTA）效果也不错。 2.2.4抗氧化剂和膜稳定剂 在精液稀释液中添加抗氧化剂，以抑制精子磷脂成分特别是不饱和脂肪酸的过氧化反应。有报道说，Ve添加到含葡萄糖、EDTA或三基的稀释液中，对绵羊进行动前处理效果较好。在赵晓娥的布尔山羊精液保存试验中添加Ve于稀释液中，精子冻后活力从34%提高到41%[30]。罗海玲等[22]在绵羊冷冻精液中添加维生素E后也极显著地减缓精子顶体畸形率的发生，减缓了冷冻对精子的伤害，明显改善了精液品质。其原因可能是精子细胞膜的过氧化物反应对精子品质有负面影响，而维生素E作为抗氧化剂，对膜的磷脂有着特殊的亲合性，在膜的特殊部位可预防或阻止诱发的脂质过氧化，保护精子细胞膜防止氧化反应发生，提高精子顶体完整性。吴结革等[3]在稀释液中添加抗氧化剂褪黑激素可有效清除化学反应中的羟自由基，抑制过氧化氢引起的过氧化脂含量的升高，而且作用比Ve, VC,谷光甘肽都高。在精液冷冻过程中，精子膜的完整性对于复苏后精子的活力和受精能力至关重要，因此，有关稀释液内膜稳定剂的研究引起人们关注。牛血清白蛋白（BSA）和锌离子通过质膜的稳定，发挥了对精子的保护作用。牧人等[25]在传统的甘油-卵黄-柠檬酸盐稀释液的基础上，在山羊中添加一定浓度的BSA和锌离子，精子细胞膜在冷冻过程中的得到保护，精子的活力和穿卵能力显著提高。2003年李拥军等[39]的试验也证实了BSA对山羊冷冻精液一定的保护作用。 2.2.5抗生素及其它 有研究表明，有些细菌的存在对精子的活力、顶体完整率产生不良影响。抗生素的添加可以延长波尔山羊的精液保存。吴结革等[3]通过在稀释液中添加恩诺沙星、庆大霉素、青、链霉素等发现，恩诺沙星的效果要优于其它。在该试验中也证实了卵黄作为保护剂使用于山羊精液稀释液中有一定的副作用。咖啡因是一种生物碱，有兴奋中枢神经的作用。黄全成等[19]将咖啡因添加到稀释液中，发现山羊精子的解冻活率提高，精子的耐冻性增强。1999年，周沛在冻前山羊稀释液中添加一定浓度的咖啡因，结果显著提高了精子的制冻效果[41]。另外，作者也发现同时添加适宜浓度的咖啡因与具有抗氧化和抗不育的Ve后，由于二者的协同作用，可更好维持精子的活力。CA Thomas等[52]测定十二烷基硫酸钠（SDS）添加于海藻糖-卵黄的稀释液中对山羊精液冷冻的影响。结果表明，在海藻糖-卵黄稀释液中添加一定浓度的SDS可使精子运动得到改善，顶体完整性也较高，从而改善了山羊的抗冻能力。毛凤显等[43]（2004）报道，在稀释液中添加谷氨酸，解冻后精子顶体完整率最高达56.75%，比对照组高10.72%。这是由于谷氨酸是精清中存在量最高的一种氨基酸，它是精子需氧代谢中可氧化的基质，对延长精子的存活是有利的。 2.2.6维生素和胆固醇的添加 近年来，有人在牛精液稀释液中添加维生素B12，结果精子的活力和顶体完整率都得到了提高，也提高了母畜的情期受胎率。于是，张培松等[42]在绵羊精液低温保存的稀释液中添加维生素B12，结果使得精子存活时间显著延长。冯彦军等[27]在绵羊和周占琴等[38]在山羊的试验中也得到相同结果。哈福等[20]在绵羊冻精稀释液中添加复合维生素B，有效提高了冻精解冻后活率并保护精子形态结构的完整性。有报道指出，复合维生素B的效果比维生素B12还好。1999年，在侯荩葆研究小尾寒羊精子内磷脂和胆固醇在冷冻前后变化的试验中发现，精子内磷脂和胆固醇含量与精子获能密切相关[18]。常用精液稀释液都添加有卵黄，卵黄中含有磷脂和胆固醇，这些磷脂和胆固醇在精液稀释和冷冻过程中可能与精子中的磷脂和胆固醇发生交换而降低精子中的胆固醇，致使精子提前获能，降低受胎率。胡日查等[15]在2004年通过添加胆固醇于山羊精液稀释液中证实了侯的研究结果，胆固醇不影响精子冻后活力但精子顶体部分脱落的比例增高而全部脱落的比例降低。Ollero M[54]等在研究不同的冷冻保护剂对羊的精细胞表面的保护时，结果显示：在脯氨酸、氨基乙酸-三甲氨乙内酯和卵磷脂等存在的情况下，并没有缓解由冷冻引起的细胞表面损伤，而在Ve和胆固醇中得到好的效果。 2.2.7除精浆 因为山羊精清中含有一种特殊物质，能与卵黄产生凝集作用。因此，在实际中要慎重添加卵黄。鉴于山羊精浆中含有卵黄凝集酶等物质，对冷冻精液品质造成不良影响。于是畜牧工作者开展去除精浆对冻后精子品质影响的研究，获得了良好的效果。2004年，在汤道玲进行的离心除精浆处理和解冻后山羊精子穿卵力试验中，精子活力和穿卵率均显著高于对照组，同时也发现，随着离心速度的增加，死亡精子数和畸形精子数也增加[20]。曹斌云等[46]和Cabrera F等[45]也通过试验发现去除精浆对精液冷冻效果的影响。 （三）精液稀释液存在的问题及个人建议 稀释液保存效果不仅与pH值、渗透压有关，还与液体物质组成密切相关。 3.1自发现甘油具冷冻保护作用后，人们对数百种潜在的冷冻保护剂（CPAS）做了检测。所选出的冷冻保护剂无一例外的含有甘油，但人们并未能精确阐述甘油作用的具体机制。同时，人们在使用甘油时，又不得不考虑到它的毒性对精子造成的危害。了解不同动物种间及个体间精子膜的分子组成结构，如构成膜的磷脂不饱和程度及膜的分子流动性间的差异是否与精子抗冻能力有直接关系。开发除甘油以外的抗冰晶形成保护剂和膜保护剂。对精子超微结构的进一步认识，可能对精子冷冻保护剂的改进和突破起重大推动作用。 3.2精细胞内冰晶的形成和渗透性物质（如电解质、非电解质等）与精子渗透压的变化有极为复杂的关系。测定这些成分和分布，有利于按物种和公畜个体的特异性，改进精液冷冻保护剂的成分，提高保护效果。 3.3 精浆作为精子的天然稀释液，其中含有许多精子正常生理所必须的物质，同时也含有对精子的稀释、保护起拮抗作用的有害物质。所以很有必要搞清精浆中物质的组成及其对精子的影响，有目的的去除精浆中的毒性物质，改进冷冻保存的稀释液、保护剂等，提高冻后品质。 3.4稀释液的成分及浓度比例不同，使得在不同的研究者在对同一种动物作相同试验时，结果存在差异，有时甚至是相反的结果。如今大量研究的目的是寻找能确保获得较好冻后存活率、生化完整性和精细胞膜稳定性的一些因素的最佳组合，并已取得进展。 3.5精子作为生命存在的一种特殊形式，保护剂和自然精液的结合是精子群体直接赖以生存的复杂环境，在同类、同种精液组成不变的情况下，保护液、解冻液的设计不是简单的某种或某几种通用物质的补充、含量的增减，而是在复杂的物质环境中起调整、维持和保护的主导作用。在稀释液中添加的成分有时相互将会产生负作用，降低了稀释液的保护效果。因此，在向稀释液中添加保护物质时，要注意物质之间的互作，正确搭配稀释液的组成成分，避免对精子品质产生额外的影响。对精子保护液的组成物质及精子与物质环境的作用关系，应该进一步研究。 3.6由于山羊精清中含有的特殊物质，可以与卵黄发生凝集作用，因此，在精清存在时，要根据精液的量来确定卵黄的含量或用奶液代替，可取得较好效果。 3.7 个体差异往往会影响稀释液的冷冻保存效果[2]。由遗传或非遗传的原因，个体对冷冻的敏感性不同，对稀释液中成分对之影响的承受能力不同，充分认识个体的生理特性，正确配制适合每一个体的稀释液，才可提高冷冻效果。 （三） 小结 人工授精已是一门成熟的技术，但其受精效果仍然较低并且在不同地区存在差异，其原因在于授精技术的各个环节中存在的问题没有彻底解决或某一技术环节还需改善。精液冷冻保存是人工授精的一项重大革新，它解决了精液长期保存的问题，使精液不受时间、地域、种畜生命的限制，极大改善了动物生产的经济效益。稀释液的应用是我们保证精液品质的主要因素。深刻认识和把握目前精液冷冻保存中存在的问题，有利于改善冻精稀释液的组成和使用，提高冷冻精液品质，从而提高人工授精效果。 参考文献 1. 陶勇，经荣斌.家畜精液冷冻保存的研究综述. 国外畜牧学-猪与禽.1999，6：39-42. 2. 刘玉堂.精液冷冻保存的影响因素.黑龙江动物繁殖.2003年第11卷第2期. 3. 吴结革等.影响精液冷冻和人工授精效果的因素.动物医学进展.2003年，24（5）：48-50. 4. 郭年藩摘译.绵羊精液冷冻保存技术研究综述（上）-稀释液.国外畜牧科技.1995年6月第22卷第3期. 5. 马毅，曹斌云.除精浆冷冻精液研究进展.2001年第22卷第4期. 6. 杨智.我国哺乳动物精子超微结构的研究进展.吉林农业科学.1990年第1期. 7. 胡传活，胡传水等.牛精液冷冻技术的研究进展.广西科学.2004年，11（4）：370-374. 8. 陈丽梅，郑鸿培.我国牛冷冻精液的发展历史和现状分析.畜禽业.2001年第11期（总第139期）. 9. 郭玉华，王元兴等.卵黄油作保护剂对奶牛冷冻颗粒精液活力的影响.四川畜牧兽医.2003年第9期（第30卷总第153期）. 10. 张文举，杨军祥等.谷光甘肽提高牛冻精活力及受胎率的研究.甘肃畜牧兽医.1997年2（总133）期. 11. 胡振尉，诸天海等.牛精液超长期保存技术的研究.黄牛杂志.1998年第24卷第6期. 12. 王锋，王兴元等.脱脂初乳与常乳在牛冷冻精液中的应用研究.中国奶牛.1997年第3期. 13. 李玉凡.维生素B12对牛精液精子质量的影响.河北农业技术师范学院学报.1998年3月第12卷第1期. 14. 王锋，王兴元等.乙二醇、丙二醇对牛冻精效果的影响.黑龙江动物繁殖.1998年第6卷第4期. 15. 胡日查，韩志金等.胆固醇对山羊精液冷冻效果的影响.畜牧与饲料科学.2004年第4期. 16. 皮文辉，张树山等.发情羊血清、肝素和BSA对绵羊冷冻-解冻精子体外获能的影响.黑龙江动物繁殖.2004年第12卷第3期. 17. 王超，周庆雨等.山羊精液冷冻过程中影响因素分析.畜牧与兽医.1995年第27卷第1期. 18. 候荩葆，郑云胜等.小尾寒羊精子内磷脂和胆固醇在冷冻前后变化的研究.草食家畜（季刊）.1999年第3期（总第104期）. 19. 黄全成、杨军祥等.咖啡因提高山羊精液冷冻效果试验.甘肃畜牧兽医.1997年11期（总132期）. 20. 哈福，赵有璋.绵羊冷冻精液稀释液中添加复合维生素B提高冻精解冻后品质的研究.甘肃农业大学学报.2003年第1期第38卷第1期，17-19. 21. 赵有璋，陈亚明等.提高绵、山羊颗粒冻精品质的研究.中国草食动物.2003年第23卷第1期. 22. 罗海玲，贾志海等.稀释液中添加维生素E对绵羊冷冻精液品质的影响.中国畜牧杂志.2004年第40卷第7期. 23. 高宏宝，赵文魁等.影响波尔山羊精液冷冻效果的因素分析. 中国草食动物.2001年第3卷第2期. 24. 胡文英，胡晓明.不同因素对多浪羊冷冻精液品质影响的分析.中国养羊.1997年第2期. 25. 牧人，王建国等.蔗糖、牛血清白蛋白和锌离子对白绒山羊精液冷冻效果的影响.畜牧兽医学报.1997年，28（2）：120-125. 26. 汤道玲等.离心除精浆对长江三角洲白山羊精液保存的影响.畜禽业.2004年第7期（总第171期）. 27. 冯彦军，张勇等.在绵羊人工授精中用VB12做稀释液可显著提高母羔比例.当代畜牧.2002年.第11期. 28. 杨灿锋，杨利国等.几种常用营养试剂对山羊精子活率的影响.江西畜牧兽医杂志.2002年第4期. 29. 陈家振. 波尔山羊冷冻精液的制作及受胎效果.当代畜牧.2004年第6期. 30. 赵晓娥，王光亚等.布尔山羊精液保存条件的试验研究.动物医学进展.1999年第20卷第2期（总第106期）. 31. 苏才旦等.两种精液稀释液对绵羊配种效果的比较.青海畜牧业.1998年第3期（总第55期）. 32. 郭年藩摘译.绵羊精液冷冻保存技术研究综述（下）-低温保护剂、冷冻及解冻.国外畜牧科技.1995年8月第22卷第4期. 33. 杨树源摘译. 绵羊冷冻精液受精率低的原因及改进方法. 国外畜牧科技.1995年10月第22卷第5期. 34. 金穗华.波尔山羊冷冻精液质量现状与分析..Animai Husbandy and Veterinary Medicine.2002,vol.34,NO3. 35. 王学君，朱红卫等. 波尔山羊冷配改良存在的问题及对策.中国草食动物.2002年专辑. 36. 金水仙，朱志伟等. 波尔山羊冷冻精液的研制.浙江畜牧兽医.2001年第4期. 37. 茆达干，杨利国等.影响低温保存效果的因素. 中国草食动物.2002年（2001-2002年全国养羊生产与学术研讨会论文集）. 38. 周占琴，武和平等.维生素B12注射液在布尔山羊精液保存中的应用.甘肃农业大学学报.1997年12月第32卷第4期，313-317. 39. 李拥军等.牛血清白蛋白（BSA）对海门山羊精液冷冻效果影响的初步研究. 中国草食动物.2003年专辑. 40. 曹斌云，姬云涛等.山羊除精浆冷冻精液的研究进展.国外畜牧科技.2001年8月第28卷第4期. 41. 周沛.咖啡因和维生素E对提高山羊冻精成活率的试验.四川畜牧兽医学院学报.1999，13（1）. 42. 张培松，周玉香等.不同比例维生素B12稀释液对小尾寒羊精子存活时间的影响.黑龙江畜牧兽医.2003年第8期. 43. 毛凤显，赵有璋等. 波尔山羊精液冷冻、解冻方法的研究. 中国草食动物.2003年专辑. （2002-2003年全国养羊生产与学术研讨会论文集）. 44. 杨凌，桑润滋等.羊精液冷冻保存技术研究进展. 中国草食动物.2004年第24卷第1期. 45. Cabrera F, Gonzalez F,et al. The effect of removal of seminal plasma, egg yolk level and season on sperm freezability of canary buck (Capra hircus).Reprod Domest Anim. 2005 Jun;40(3):191-195. 46. Aisen E, Quintana M,et al.Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hyper-tonic extenders. Cryobiology. 2005 Jun;50(3):239-49. Epub 2005 Mar 29. 47. Lukoseviciute K, Zilinskas H, Januskauskas A. The effect of oestradiol, progesterone and heparin on bovine spermatozoa function after thawing. Reprod Domest Anim. 2005 Apr;40(2):100-7. 48. Amirat L, Anton M, Tainturier D,et al. Modifications of bull spermatozoa induced by three extenders: Biociphos, low density lipoprotein and Triladyl, before, during and after freezing and thawing. Reproduction. 2005 Apr;129(4):535-43. 49. O'Flaherty C, Rodriguez P, Srivastava S. L-arginine promotes capacitation and acrosome reaction in cryopreserved bovine spermatozoa. Biochim Biophys Acta. 2004 Sep 24;1674(2):215-21. 50. Awad MM, Graham JK. A new pellet technique for cryopreserving ram and bull spermatozoa using the cold surface of cattle fat. Anim Reprod Sci. 2004 Aug;84(1-2):83-92. 51. Aboagla EM, Terada T. Effects of the supplementation of trehalose extender containing egg yolk with sodium dodecyl sulfate on the freezability of goat spermatozoa. Theriogenology. 2004 Sep 1;62 (5):809-18. 52. CA Thomas, DL Garner,et al. Effect of cryopreservation of bovine sperm organelle function and viability as determined by flow cytometry. Biology of Reproduction, 1998，Vol 58, 786-793. 53. Bilodeau JF, Blanchette S, Cormier N, Sirard MA. Reactive oxygen species-mediated loss of bovine sperm motility in egg yolk Tris extender: protection by pyruvate, metal chelators and bovine liver or oviductal fluid catalase. Theriogenology. 2002 Feb;57(3):1105-22. 54. Ollero M, Blanco TM,et al. Surface changes associated with ram sperm cryopreservation revealed by counter-current distribution in an aqueous two-phase system. Effect of different cryoprotectants. J Chromatogr B Biomed Appl. 1996 May 17;680(1-2):157-64. 55. Eiman M.-E. Aboagla and T. Terada. Trehalose-Enhanced Fluidity of the Goat Sperm Membrane and Its Protection During freezing . Biol Reprod. May 21, 2003. 56. Moussa,Martinet,et al.Low density lipoproteins extracted from egg yolk by an easy method;cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen.Theriogenology,2002,57:1695-1706.

我来说两句