用毛细管电泳-激光诱发荧光技术对谷氨酸标准曲线绘制

路镇穗1,2，顾钧1，杨国栋1，赵伟康2，张亚海1

1(莨菪药物与微循环研究所 宁波 315010) 2(上海中医药大学 上海 201203)

[摘要] 目的 绘制谷氨酸标准曲线 方法 高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis(HPCE))法 毛细管60cm×75um；运行缓冲液：四硼酸钠缓冲液（PH 10），气压进样5s，分离电压25kv，温度25℃，检测波长240nm 结果：谷氨酸在10-4—10-6 mol/L浓度范围内，谷氨酸的浓度与峰面积之间有良好的线性关系，检测方法稳定 结论：所用方法简单，快捷，灵敏。

[关键词]：谷氨酸,高效毛细管电泳法,标准曲线

1 引 言

高效毛细管电泳(CE)-是一种对化学和生物化学组分进行分离技术。具有高灵敏度、高分辨、分离速度快、进样量少等优点。毛细管电泳一激光诱发荧光(CE—LIF)检测技术已成功用于痕量氨基酸和单胺类物质的测定。使用荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate,FITC）对待测样品中氨基酸衍生，一般是在PH9.5-10的缓冲液中，室温反应12-16小时[1]。本文采用高效毛细管电泳法对谷氨酸标准品做标准曲线简单，快捷，灵敏，并获得了准确可靠的检测方法。

2 实验部分

2.1 动物与材料

雄性小鼠，体重30±2 g，由杭州实验动物中心提供.

2.2 仪器与试剂

高效毛细管电泳为Beckman公司P/ACE System 5000。谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）标准品为Sigma公司产品，FITC为Amersco公司产品，其他试剂为分析纯；去离子水由MILLI-Q Labo仪器制备，毛细管电泳分离在ID 75um×67cm 的毛细管中进行，He离子激光激发波长488 nm，发散波长520 nm,20 mmol／L四硼酸钠缓冲液(pH 9．5)，气压进样5 s，电泳温度25℃ ，工作电压25 kV，恒压电泳，分离时间25 min。用Beckman Station软件收集并处理信号.

3 结果与讨论

3.1 电泳操作条件

毛细管在每次使用前用0.1NaOH冲洗5min，然后用超纯水冲洗5min，再用电泳缓冲液冲洗5min，采用气压进样，进样5s，柱温25℃，检测波长240nm，根据上述电泳操作条件，得谷氨酸标准品的电泳图。

3.2 标准曲线绘制

配制10-4—10-6mol／L系列浓度的L—Glu标准品溶液；用丙酮配制100 umol／L FITC，-20℃冰箱待用，衍生和分离分别在20 mol／L硼酸缓冲液（PH 10），四硼酸钠缓冲液（PH 9.5）中进行。

3.3 线性关系的考察：

精密称取谷氨酸，以谷氨酸浓度为横坐标主峰面积为纵坐标作图，且谷氨酸的荧光图形与文献中测荧光谷氨酸图形类似[2]，计算L—Glu标准品的峰面积与标准品浓度之间的回归方程为Y=2.1E+08+0.996x ，r=0．996*，P<0.05。在统计学上有意义。

根据上述电泳操作条件，得电泳图（图1和图2），图1 (A)表示空白对照（未加谷氨酸标准品）和(B)表示加谷氨酸标准品（5×10-5M）时的电泳图，(B)比(A)中多出的峰为谷氨酸标准品的峰，相同的峰为荧光素异硫氰酸酯的峰。图2 (C)表示加不同浓度谷氨酸时的不同电泳图的叠加，完全叠加的相同峰为荧光素异硫氰酸酯的峰.而(D)表示加不同浓度谷氨酸标准品的峰，峰高低与谷氨酸浓度成直线相关关系。 在10-4——10-6mol／L浓度范围内谷氨酸的浓度与峰面积之间均有良好的线性关系。每个谷氨酸标准品均做平行管，跑出荧光峰面积相同，表明分析方法的重复性较好，方法稳定。

由于大多数氨基酸本身不带荧光，所以在使用毛细管电泳-激光诱发荧光技术检测前样品需要衍生。在pH 9．5—10的缓冲液中，室温反应12—16 h，使用荧光素异硫氰酸酯(fluoresein isothiocyanate，FITC)对谷氨酸标准品衍生，根据谷氨酸标准品分离后对应的峰面积和L—Glu的浓度，即可计算得到谷氨酸标准品中L-Glu的标准曲线。研究表明，柱温降低分离度变好，但柱效降低，分析时间变长。综合考虑分离度和迁移行为的变化，实验选用25℃柱温较合适。分离电压25kV是毛细管电泳的一项重要参数，实验表明，增加组分的迁移速度是减少谱带展宽，提高分离效率的重要途径，增加电场强度可以达到提高速度的目的。但高场强度导致通过毛细管的电流增加，从而增大焦耳热，因此，在25 kV时，分离选择性最佳。

应用高效毛细管电泳法测定样品中的痕量氨基酸和单胺类物质前先做出标准曲线，在此电泳操作条件下，做标准曲线的方法，简便，易行，快捷，灵敏重复性较好，可做为样品中谷氨酸测定前的必需步骤。

References

1. CAO JunLi(曹君利),ZHANG YaHai(张亚海)，GU Jun(顾钧), Application of combination of capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence:measurement of glutamate and arginine in PAG microdialytes of conscions morphine-withdrawal rats.Acta Physiologica Sinica(生理学报)，2003，55（5）：612-616.

2.Luis Hernandez,Sonia Tucci,Norberrto Guzman,et al. In vivo monitoring of glutamate in the brain by microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection.Journal of Chromatography A,1993(652):393-398.

A B

图1 (A)表示空白对照（未加谷氨酸标准品）和(B)表示加谷氨酸标准品（5×10-5M）时的电泳图，(B)比(A)中多出的峰为谷氨酸标准品的峰，相同的峰为荧光素异硫氰酸酯的峰.

Fig.1 Electropherograms of (A) a blank and (B)5×10-5M standard solution of glutamatee.Peaks of FITC products are observed.The glutamate peak is the different one.

C D

图2 (C)表示加不同浓度谷氨酸时的不同电泳图的叠加，完全叠加的相同峰为荧光素异硫氰酸酯的峰.而(D)表示加不同浓度谷氨酸标准品的峰，峰高低与谷氨酸浓度成直线相关关系。

Fig.2 Peaks of FITC products are observed. Electropherograms of (C) a different-dose added glutamate and (D) the enlarged peaks of different-dose added glutamate.

Application of Combination of Capillary Electrophoresis with Laser-induced Fluorescence：Measurement of Glutamate Standard Curve

LU Zhensui1,2,Gu Jun1,Yang Guodong1,Zhao Weikang2,Zhang Yahai1

1(Ningbo Institute of Microcirculation and Henbane,Ningbo 315010)

2(Shanghai Traditional Chinese Medical, Shanghai 201203)

[Abstract] Objective:To determination the calibration curve of glutamate.Method: high performance capillary electrophoresis(HPCE) was used.The best assay condition was achieved with a fused silica capillary tube(60cm×75um),20mmol/L sodium tetraborate buffer (PH 10),at a constant voltage of 25kv and at temperature of 25℃.The laser detection wave length was at 240nm.Result:The calibration curve were linear in the range of 10-4__10-6mol/L for glutamate(r=0.996*) Conclution:this method is simple,rapid and sensitive.

[key words]: glutamate; high performance capillary electrophoresis(HPCE); standard curve

用毛细管电泳-激光诱发荧光技术对谷氨酸标准曲线绘制

路镇穗1,2，顾钧1，杨国栋1，赵伟康2，张亚海1

1(莨菪药物与微循环研究所 宁波 315010) 2(上海中医药大学 上海 201203)

[摘要] 目的 绘制谷氨酸标准曲线 方法 高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis(HPCE))法 毛细管60cm×75um；运行缓冲液：四硼酸钠缓冲液（PH 10），气压进样5s，分离电压25kv，温度25℃，检测波长240nm 结果：谷氨酸在10-4—10-6 mol/L浓度范围内，谷氨酸的浓度与峰面积之间有良好的线性关系，检测方法稳定 结论：所用方法简单，快捷，灵敏。

[关键词]：谷氨酸；高效毛细管电泳法；标准曲线