毒害艾美耳球虫初次感染雏鸡免疫器官IL-2和淋巴细胞增殖功能变化 |
| 作者: 郑世民，胡京友，刘晶，高雪丽 |
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毒害艾美耳球虫初次感染雏鸡免疫器官IL-2和淋巴细胞增殖功能变化 郑世民，胡京友，刘晶，高雪丽 （东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨，150030） 摘要： 应用组织匀浆涂片和酸性α－醋酸萘酯酶(ANAE)染色及细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐（MTT）测定法对毒害艾美耳球虫(eimeria necatrix, E.necatrix)初次感染雏鸡免疫器官的T细胞百分数、白细胞介素-2 (interleukin-2, IL-2)诱生活性、T和B细胞对ConA或PMA的增殖功能的动态变化进行了较全面系统的研究。结果发现，E.necatrix初次感染雏鸡，其胸腺和脾脏T细胞百分数分别于感染后7～21和7～24天明显高于对照雏鸡；IL-2诱生活性分别于16~18和18~21天较对照雏鸡显著升高； T细胞对ConA的增殖反应分别在14~16和10~18天明显增加。法氏囊和脾脏B细胞对PMA的增殖反应分别于14~24和14~21天显著高于对照雏鸡。表明E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官的IL-2调节及细胞免疫和体液免疫功能均明显提高。 关键词：毒害艾美耳球虫；雏鸡；免疫器官；白细胞介素-2； T、B数量及其增殖功能 Changes of Proliferative Responses and Interleukin-2 Activity of Lymphocytes in Immune Organs of Chickens Primary Infected with E. Necatrix ZHENG Shi-min, HU Jing-you, LIU Jing, GAO Xue-li (College of Animal Medicine, Northeast Agricultural University,Heilongjiang, Harbin, 150030) Abstract：Dynamic changes of percentage of T cell，interleukin-2(IL-2) activity and proliferative response of T and B lymphocytes to concanavalin A(ConA) or phorble myristate acetate(PMA) in immune organs of 14-day-old chickens primary infected with E. necatrix were studied by using acid nonspecific α- naphthyl acetate esterase(ANAE), cellular culture technique and [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) method. These results discovered that the IL-2 activity in thymus and spleen of chickens primary infected with E.necatrix was significantly increased compared with that of control, respectively, at day 16-18 and 18-21 post primary infection (PPI), The proliferative responses of T lymphocytes to ConA in thymus and spleen of chickens infected with E. necatrix were significantly elevated compared with control chickens at day 14-16 and 10-18 PPI, respectively. The proliferative responses of B lymphocytes to PMA in spleen and bursa of Fabricius of chickens infected with E. necatrix were significantly higher than that of control at 14-24 and 14-21 PPI, respectively. These results showed that IL-2 immune regulation and function of cellular immune and fluid immune in immune organs of chickens primary infected with E. necatrix had significantly increased. Key words：E. necatrix；chicken；immune organ；IL-2；number and function of T and B cells 鸡球虫病(Coccidiosis)是由艾美耳属（Eimaeia）的一种或几种球虫寄生于鸡肠道黏膜上皮细胞而引起的原虫病[1]。该病是严重危害养鸡业发展的世界性重要肠道寄生虫病之一[2]。对球虫病的防治药物一直占主导地位。近年来，随着耐药球虫株的产生，特别是药物残留对畜产品和人类健康以及环境的影响[3]。寻找控制球虫病的有效途径，已成为广大兽医学工作者探索和关注的热点。根据已有的研究资料，对球虫生活史、流行病学、抗原组分和疫苗研制等研究较多[4]，并取得了一定的进展；而对球虫免疫发病机制的研究较少。特别是毒害艾美耳球虫感染雏鸡后，其免疫器官细胞因子免疫调节及其T、B淋巴细胞对ConA或PMA增殖功能的变化，尚未见有研究报道。因此，本项研究对14日龄艾维因2000肉用雏鸡感染毒害艾美耳球虫后，其免疫器官T细胞白IL-2活性和T、B淋巴细胞对ConA或PMA的增殖反应的动态变化进行了全面系统的研究，为进一步研究球虫病的免疫防制提供科学依据。 基金项目：黑龙江省自然科学基金 (C0206) 作者简介：郑世民（1959.9-），男，教授，博士，从事禽病免疫病理研究工作, E-mail: z1.材料与方法 1.1毒害艾美耳球虫（E.necatrix）强毒株 中国农业大学寄生虫教研室惠赠。 1.2主要试剂及生物制剂 刀豆蛋白A(ConA)、RPMI-1640、四甲基偶氮唑盐（MTT）、乙酸豆蔻佛波醇(PMA)、α-甲基-D-甘露糖苷（α-MM）、Hepes等，均购自Sigma公司。 1.3实验动物及其分组和处理 120只1日龄健康艾维因2000肉用商品混合雏鸡，购自哈尔滨市某孵化场，经ND、MD、IBD、CIA及鸡球虫虫卵检查均为阴性，然后在严格消毒无球虫的环境中饲养至14日龄，并随机分为：球虫感染组（I组）和未感染球虫的对照组（C组）,每组各60只雏鸡。I组雏鸡于15日龄，经口感染8×103个/只感染性卵囊；C组雏鸡未感染球虫卵囊为对照组。两组雏鸡严格隔离，在相同条件下分别饲养管理。 1.4实验材料采取 分别于感染球虫卵囊后2、4、7、10、14、16、18、21、24、28天，每组随机抽取5只雏鸡，心脏采血处死后，无菌采取胸腺、法氏囊和脾脏，分别制成单细胞悬液，供相应各项免疫指标检测用。 1.5检测指标及方法 1.5.1 胸腺和脾脏T淋巴细胞百分含量测定：采用组织匀浆涂片及酸性α－醋酸萘酯酶(acid nonspecific α- naphthyl acetate esterase ,ANAE)染色法[5]； 1.5.2 胸腺和脾脏IL-2诱生活性及增殖反应: 体外细胞培养和ConA诱生及MTT比色法[6，7]； 1.5.3 法氏囊和脾脏B淋巴细胞增殖反应: 体外细胞培养和PMA诱生及MTT比色法[6，7]。 1.6数据处理 用Minitab软件包进行统计学处理，经t检验分析组间差异, 结果用平均值±标准误表示。 hengshminbl@sohu.com2.结果 2.1 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞IL-2诱生活性的动态变化 表1 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞IL-2诱生活性变化 Table 1 Changes of IL-2 activity of T lymphocytes in immune organs of chickens primary infected with E.necatrix (A590nm) 天数days 7 14 16 18 21 24 胸腺thymus C 0.2401±0.0523 0.2782±0.0518 0.2818±0.0319 0.2871±0.0208 0.2658±0.0306 0.2170±0.0313 I 0.2531±0.0578 0.3011±0.0626 0.3208±0.0211* 0.3918±0.0118** 0.3518±0.0362* 0.2326±0.0226 脾脏spleen C 0.2398±0.0387 0.2757±0.0235 0.2981±0.0215 0.2897±0.0429 0.2718±0.0302 0.2611±0.0610 I 0.2589±0.0564 0.3209±0.0311* 0.3918±0.0103** 0.3578±0.0497* 0.3011±0.0354* 0.2810±0.0513 注：（1）C—对照组；I— 球虫感染组； （2）** p<0.01，* p<0.05；无标记者差异不显著p>0.05。下同。 Note: (1) C— control group I— group infected with E. necatrix；(2) The values with asterisk differ significantly (with single asterisk, p<0.05) or very significantly (with double asterisk, p<0.01) and vise versa. 14日龄雏鸡初次感染E.necatrix后28天内，其胸腺和脾脏T淋巴细胞IL-2诱生活性分别于16~21和14~21天明显高于对照雏鸡（p<0.05或p<0.01）；并分别于18和16天达高峰。 2.2 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞数量的动态变化 表2 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞数量变化 Table2 Changes of the number of T lymphocytes in immune organs of chickens primary infected with E.necatrix (Unit：%) 天数days 7 14 16 18 21 24 胸腺thymus C 21.5±2.89 26.7±3.51 31.0±2.65 27.0±1.00 25.0±5.02 29.0±4.36 I 27.5±4.56* 50.4±5.20** 52.7±5.20** 39.3±1.53** 33.3±2.08* 24.3±2.89 脾脏spleen C 20.3±1.53 29.3±2.52 27.0±2.65 24.7±3.94 29.3±4.93 26.7±2.73 I 28.7±4.00* 57.3±4.16** 60.7±3.22** 46.4±2.08** 37.3±2.08* 32.0±3.58* 雏鸡初次感染E.necatrix后，其胸腺和脾脏T淋巴细胞数量分别于感染后7～21和7～24天明显高于对照雏鸡（p<0.05或p<0.01），并于16天达最高峰。其余未见统计学差异。 2.3 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞增殖反应的动态变化 表3 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官T淋巴细胞增殖反应变化 Table3 Changes of proliferative responses of T lymphocytes to ConA in immune organs of chickens primary infected with E. necatrix (A590nm) 天数days 7 14 16 18 21 24 胸腺thymus C 0.1238±0.0166 0.1451±0.0238 0.1162±0.0168 0.1326±0.0178 0.1103±0.0162 0.1020±0.0126 I 0.1401±0.0218 0.2308±0.0418* 0.2798±0.0306** 0.1811±0.2011* 0.1431±0.1865 0.1131±0.0175 脾脏spleen C 0.4368±0.0501 0.4800±0.0521 0.4868±0.0602 0.4301±0.0481 0.4598±0.0526 0.4826±0.0512 I 0.4898±0.0598 0.8801±0.0912** 0.8612±0.0926** 0.6971±0.0721** 0.5602±0.0678* 0.4510±0.0489 14日龄雏鸡初次感染E.necatrix后2～28天，其胸腺和脾脏T细胞增殖反应分别于14~18和10～21天明显高于对照雏鸡（p<0.05或p<0.01），并分别于16和14天达到峰值。 2.4 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官B淋巴细胞增殖反应的动态变化 表4 E.necatrix初次感染雏鸡免疫器官B淋巴细胞增殖反应变化 Table4 Changes of proliferative responses of B lymphocytes to PMA in immune organs of chickens primary infected with E. necatrix (A590nm) 天数days 7 14 16 18 21 24 法氏囊bursa C 0.4712±0.0521 0.5118±0.0589 0.4802±0.0526 0.6012±0.0718 0.5717±0.0686 0.7011±0.0817 I 0.5201±0.0608 0.7126±0.0812* 0.9801±0.1121** 1.1898±0.1157** 1.1021±0.1208** 0.9302±0.1098* 脾脏spleen C 0.4612±0.0578 0.4918±0.0598 0.3942±0.04027 0.5430±0.0621 0.5571±0.6226 0.3690±0.0468 I 0.4696±0.0591 0.6812±0.0768* 0.9801±0.1226** 0.8812±0.0989** 0.7611±0.0829* 0.4208±0.0511 14日龄雏鸡初次感染E.necatrix后2～28天，其法氏囊和脾脏B淋巴细胞增殖反应分别于14~24和14～21天明显高于对照雏鸡（p<0.05或p<0.01），并分别于18和16天达峰值。 3.讨论 3.1 E.necatrix初次感染对鸡IL-2活性变化的影响及其机制 IL-2是主要由T淋巴细胞(CD4+ 和CD8+T细胞)产生的分子质量为15.5kD的糖蛋白，其在动物机体的免疫系统中发挥重要的调节作用，是多种细胞的有效生长因子，包括T细胞的分化、B细胞的增殖、NK细胞的活化等[8]都是在IL-2的调节下完成的。据报道[9]，IL-2在抵抗E.tenella和E.acervulina球虫感染中具有十分重要的作用。Miyamoto等[10]研究发现，雏鸡在首次感染E.tenella后7天，其血清IL-2活性明显高于对照雏鸡，且可介导机体对再感染的免疫回忆应答。Li等[11]和Choi等[12]分别用E.tenella和E.acervulin感染雏鸡，结果发现，雏鸡感染E.tenella后，其淋巴细胞培养物上清中IL-2含量显著升高；E.acervulin感染雏鸡，其脾脏和肠内的IL-2 mRNA表达明显增强。表明，E.tenella和E.acervulin感染雏鸡后，可能是通过上调IL-2mRNA的表达水平，介导细胞免疫反应，从而抵抗球虫的再侵袭。而E.necatrix感染雏鸡后，其IL-2活性发生什么样的变化？迄今尚未见有报道。本研究发现，雏鸡初次感染E.necatrix后，其胸腺和脾脏T细胞IL-2活性分别于16~21和14~21天明显高于相应对照雏鸡，提示雏鸡初次感染E.necatrix后一定时段内，IL-2同样发挥十分重要的作用。但是，E.necatrix初次感染雏鸡后，其免疫器官T细胞IL-2活性变化时相与其他艾美耳球虫不同，存在明显滞后现象。产生上述变化是否与E.necatrix在动物体内的发育史、本身的抗原性等有关，尚需进一步实验证实。艾美耳球虫感染雏鸡后，IL-2活性增强，可与其他细胞因子共同作用加速T细胞的早期发育，进而促进Th细胞和CTL细胞的生成，胸腺T细胞IL-2分泌增多，使幼稚T细胞分化为成熟Th细胞、CTL细胞作用增强，脾脏T细胞依赖区的CTL细胞，尤其是Th细胞数量增加，以提高机体细胞免疫功能，进而抵抗球虫的再感染。 3.2 E.necatrix初次感染对鸡淋巴细胞增殖功能变化的影响及其机制 本研究发现，雏鸡初次感染E.necatrix后，其胸腺及脾脏T细胞增殖功能，分别在14～18和10～21天显著高于对照雏鸡，表明细胞免疫与机体抵抗E.necatrix侵袭密切相关。T细胞介导的细胞免疫在抗球虫免疫中处于核心地位。E.necatrix侵入雏鸡肠黏膜上皮细胞后，其子孢子和第一代裂殖子可刺激T细胞活化、增殖、分化为CD4＋和CD8＋T淋巴细胞。CD4＋T细胞是主要诱导群，具有Th细胞功能，识别MHCⅡ类分子相关抗原，通过产生多种细胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，抑制各阶段幼虫在肠道内的寄生，从而参与机体的抗球虫免疫；上述细胞因子又可激活巨噬、LAK及NK等杀伤性细胞，调节免疫应答；也可辅助B细胞和TCR3细胞的免疫应答和细胞毒性反应[13,14]。因此，CD4＋T细胞是启动和参与抗球虫免疫应答的重要免疫活性细胞之一，在球虫的保护性免疫中处于主导地位。细胞免疫机制与抗E.necatrix感染密切。但体液免疫在抗球虫中的作用不应被忽视[15]，本研究发现，雏鸡初次感染E.necatrix后，其法氏囊和脾脏B细胞增殖功能分别于14~24和14~21天明显高于对照雏鸡，表明雏鸡感染E.necatrix球虫后，其免疫器官的体液免疫功能也增强，细胞免疫和体液免疫两者相互协同，在抗球虫感染中发挥十分重要的作用。 参考文献： [1]索勋, 李国清. 鸡球虫病学[M].北京：中国农业大学出版社,1998 [2] Williams R.B. 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