谷子（Setariai talica）的分子生物学研究进展 |
| 作者:刘颖慧 |
| 摘要 | |
| 摘要：谷子主要在干旱和半干旱地区种植。本文综述了谷子的组织培养和基因转化的研究进展。谷子组织培养技术已经成熟，使用不同的外植体都获得了组培的成功。比较其他主要作物而言谷子基因转化研究还非常少，基因转化方法少，转化品种有限。本文综述生物技术在谷子中的应用进展，阐明目前存在的问题同时对今后发展的方向进行探讨。 | |
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谷子（Setariai talica）由于其种子和茎秆可以食用，因此可以作为食物、食品和草料，在中国、日本、印度和非洲地区大面积种植，而在一些西方国家，他们种植面积较小，而且主要作为鸟食。谷子耐旱和耐贫瘠的生理特性使它们在土壤贫瘠和干旱的地区可以生长并且能够保证产量，目前有的土壤贫瘠和贫困地区的农民仍然以谷子为主要粮食。2025年为满足人口增长的需要，对粮食的需求量也增加，同样要求谷子产量要从现在的水平提高一倍（2002年的2.5tha-1提高到4.5tha-1）[1]。谷子产量的提高不仅需要常规的作物育种技术，更需要通过基因工程技术，利用优质、高产的基因资源来提高谷子的产量。 1 谷子的组织培养 谷子组织培养的尝试要追溯到二十世纪七十年代，Rangan等成功的诱导出谷子的愈伤组织同时获得了再生植株[2]。在80年代期间Vasil, Marrish等对谷子的组织培养做了大量的探索和研究，在原生质体的悬浮培养和胚性愈伤组织的培养中都获得了成功[3,4]。我国谷子组织培养较早的报导来自许智宏[5]，曾用谷子的幼穗与狗尾草的幼穗做外植体并比较它们不同的组培条件，获得了谷子的再生植株；随后90年代在原生质体和体细胞无性系的培养中也获得成功[6,7]。 谷子的组织培养能否成功与培养基的组成、生长调节因子、外植体等因素密切相关，同时谷子的组织培养还具有品种依赖性，表1综述了几种主要谷子品种不同的组织培养条件[8]。 表1.谷子的组织培养 Table 1.Millet Tissue Culture. 谷子品种 Species 外植体 Explants 诱导愈伤的激素 Regulators 培养基 Medium 主要参考文献 References Echinochloa colona 幼穗，未成熟种子，幼胚 2,4-D, BAP, NAA MS,LS [9] E. frumentacea 叶片，幼胚 2,4-D MS [10] Eleusine coracana 种子，上胚轴，幼胚 2,4-D, NAA, IBA, BAP,GA3 MS [8] E. indica 幼穗，未成熟种子 2,4-D, GA3 MS [11,12] Panicum bisulcatum 幼胚，种子，幼茎 2,4-D 改良的MS [13] P. maxicum 幼胚，种子 2,4-D, NAA MS [14] P. miliaceum 胚，叶片，种子 2,4-D, 2,4,5-T, BAP MS [15] P. milioides 未成熟种子，幼穗 2,4-D MS [16] Paspalum dilatatum 幼穗，幼胚 2,4-D 改良的MS [13] P. notatum 种子，胚 2,4-D, BAP MS [17] P. scrobiculatum 茎，种子 2,4-D, NAA, BAP MS [18] P. simplex 胚，幼胚，种子 NAA, BAP 2,4-D, N6,MS [15,19] P. vaginatum 种子，胚轴 2,4-D MS [19] Pennisetum americanum 未成熟种子 2,4-D, IAA MS,LS [20,21] P. glaucum 幼胚，幼穗 2,4-D, pCPABAP MS [22] P. typhoides 种子，胚 2,4-D2,4,5-T, IAA MS [23] Setaria italica 上胚轴，种子 2,4-D, 2,4,5-T, BAP LS [24] 2 谷子的基因转化 利用生物工程手段对主要的粮食作物（玉米、水稻和小麦等）进行遗传转化已经是非常普遍和可行的方法，将来要提高谷子的产量，改善它的品质，单靠组织培养已经不能满足要求，利用生物工程的方法是必须的。谷子的基因工程操作虽然起步较晚，研究报导也不多，但是也取得了一定的进展。 2.1 转化的方法 目前谷子的基因转化主要有两种方法，原生质体转化和基因枪法。获得谷子的原生质体后可以通过电激和化学方法将外源DNA导入到细胞中[25], 但是用原生质体转化总是存在品种依赖性的问题，而且对原生质体的操作存在一些不确定的因素，自从基因枪发现以来，将外源的DNA直接导入植物细胞已经成为可能，将金粉轰击到谷子未成熟的胚和胚性愈伤组织中已经获得了转化植株[26]。 基因枪转化谷子成功后Girgi,Goidman等又相继探讨了不同的外植体、不同的转化方法、选择标记对转化效果的影响，在转化过程中研究了影响转化效率的各种参数[27,28]，目前在几个谷子品种中已经有基因转化实验的报道，有的品种获得了转基因植株（表2）。 表2.谷子的遗传转化 Table 2.Millet Gene Transformation 谷子品种 Species 外植体 Explants 报告/选择基因 Reporter/Marker Genes 转化结果 Results 参考文献 References Echinochloa crusgalli 叶片 uidA 基因的瞬间表达 [29] Eleusine coracana 愈伤组织和叶片 uidA 基因的瞬间表达 [29] Panicum maximum 原生质体 nptII, dhfr, hph 基因的瞬间表达 [25] Paspalum notatum 愈伤组织 bar 转基因植株 [30] Pennisetum americanum 原生质体，茎尖端 nptII, dhfr, hph 基因的瞬间表达 [25] P. glaucum 胚 uidA 基因的瞬间表达 [20,21] P. glaucum 原生质体 uidA, hph, bar, nptII 转基因植株 [31,32] P. glaucum 茎段 uidA, bar 转基因植株 [27] P. glaucum 胚性愈伤组织 uidA, bar, gfp 转基因植株 [28] P. glaucum 胚 manA 转基因植株 [33] 2.2 转化载体 研究表明启动子、增强子、内含子和 polyA 都是影响外源基因在植物中转化成功与否和转化效率高低的重要因素。启动子的启动活性和基因的表达效率密切相关，Troy研究了CAMV35S启动子和玉米ubiquitin启动子在谷子中的启动活性，结果表明使用ubiquitin启动子GUS的表达活性比使用35S启动子增加10倍，这表明玉米的ubiquitin启动子更加适合谷子等禾本科作物的遗传转化[20]。刁现民等也做了相同的实验，获得了相似的结果[34]。Lambé 等[31,32]尝试使用CAMV 35S，Emu和Adh1启动子和35S ocs 和 nos终止子组合构建不同的表达载体，检测gus基因的表达情况，研究表明，最高的GUS表达效率是利用Emu启动子、nos终止子同时中间有 Adh1内含子的表达载体中获得的。 2.3 选择标记 卡那霉素是基因枪转化中常用的选择标记基因，但是在培养过程中卡那霉素对转化材料损伤较大，后代经常不能获得育性。潮酶素作为选择标记在玉米和水稻的转化中应用较多，Lambé [31]等尝试用潮酶素作为谷子转化的选择标记，结果表明潮酶素抗性愈伤组织培养两年而没有丧失其抗性，但是植株没有能够再生。2000年Lambé等又报道获得了II型潮酶素抗性愈伤，用潮酶素b在转基因植株的选择中认为是可行和有效的，可以获得可育的植株[32]。Girgi等使用bar基因转化到谷子的4个品系中，获得了转基因植株，对Ti后代进行分析表明该基因已经整和到谷子的基因组中[27]。O’Kennedy等最近报道在玉米的ubiquitin的启动子下，用未成熟的胚作为转化受体，在谷子中转化man A基因，获得了可育的植株，man A基因在T1和T2代都得到了稳定的表达，而且该基因比bar基因的表达效率高，更加适合谷子的转化[33]。 2.4 外源基因的整和、表达和传递 Lambé 等[32]分析了外源基因在谷子中的整和情况，对转化的植株提取DNA，以潮霉素为探针进行Southern杂交，表明外源DNA转化到谷子基因组中的拷贝数为1-10个，潮霉素和gus基因共转化的拷贝数为1-4个，在种植一年后发现gus基因沉默，这种基因活性的丧失是由于基因甲基化引起的。Lambé[31]等在转化了带hpt基因和gus基因的载体后，通过Southern杂交发现潮酶素抗性基因和gus基因共转化的几率是60%，获得的转基因植株的表型是正常的，但是有的表现矮化、有的表现为叶子卷曲，这是基因枪轰击的结果，对于所有的转化事件都有可能发生。对植株的育性研究表明，植株的育性和株系有关，多数植株是可育的，110株转基因植株中获得了69株可育植株，但是植株的结实率有差异，有的植株仅获得几粒种子而有的植株种子数量很多。O’Kennedy 等[34]在研究中发现，在转基因中基因的转移和共分离也是经常会发生的，发生的比例多为1:1，许多自花受粉的植株共分离的比例为3:1。通过Southern杂交分析转化的18株植株，有8株有独特的分离方式，这也表明他们属于不同的转化事件，虽然有的植株和品系中基因是高拷贝的插入，但是只有4-9个拷贝的转化品系才能产生下一代，第一代经常产生极少的种子，但是后代的表型是正常的，同时可以产生大量的种子。 3 展望 尽管对不同谷子品种来说谷子的体外培养技术已经成功好多年[3]，但是谷子的遗传转化却远远落后于其他的主要作物，一方面是由于在经济发达国家谷子占的生产地位不重要，因此对它的研究所投入的经费不足，同时谷子还不是一个模式作物，可以用统一的模式系统来转化所有的谷子品种。虽然农杆菌已经成为禾谷类作物遗传转化的主要方法[14]，但是谷子在这方面的遗传转化的研究报导非常少，主要是人们对谷子的研究非常少，同时目前对谷子的改良主要是提高产量而不是改善他的品质，因此对谷子的遗传操作还有限。谷子转化还存在的问题是由于一些品种受种植面积的限制，种植地域窄，种植面积小，因此在研究中经常被忽视，对谷子品种的转化多数用珍珠谷[32,30]，所以挖掘谷子新的有利的基因同时研究和探索它的遗传转化方法也是将来谷子分子生物学操作必须补充和完善的。 |
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